在生物制藥領(lǐng)域,蛋白質(zhì)表達和產(chǎn)量直接影響著(zhù)藥物研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。然而,一些蛋白質(zhì)由于其獨特的結構和特性被歸類(lèi)為“難表達蛋白”,難以在常規表達系統中實(shí)現高效表達。蛋白質(zhì)難以表達的原因多種多樣,主要涉及分子結構、穩定性和細胞環(huán)境等因素。
首先,某些蛋白質(zhì)具有復雜的三維結構,如高二硫鍵密度或多亞基復合體,使其在合成過(guò)程中易于錯誤折疊,進(jìn)而在細胞中形成不溶性聚集體,影響表達效率。其次,對于高疏水性或需要特定糖基化修飾的蛋白,如膜蛋白、凝血因子等,細胞難以在常規條件下維持其穩定結構,進(jìn)一步加劇表達困難。此外,某些蛋白質(zhì)本身具有細胞毒性作用,例如蛋白酶和凝血酶在過(guò)表達時(shí)會(huì )誘導細胞凋亡,導致表達量驟降。外部環(huán)境的影響同樣不可忽視,表達系統中的異常應激反應、代謝物濃度的波動(dòng)或翻譯后修飾的缺失都會(huì )導致蛋白質(zhì)的不完全表達甚至降解。
以上這些原因共同導致的難表達蛋白藥物的表達量偏低,已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)CMC開(kāi)發(fā)過(guò)程中的主要瓶頸。為解決這一長(cháng)期存在的產(chǎn)業(yè)難題,漢騰生物研發(fā)了專(zhuān)注于難表達蛋白(Difficult to express protein)的DTEasy工具箱。該平臺以集成優(yōu)化策略為基礎,全面提升難表達蛋白的產(chǎn)量、穩定性和功能性,為客戶(hù)難表達蛋白藥物開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)系統化和全面的解決方案。
DTEasy的四大核心策略
DTEasy平臺通過(guò)分子改良、宿主選擇、載體優(yōu)化和工藝構建四個(gè)關(guān)鍵策略,全方位解決難表達蛋白的表達挑戰。
分子改良
優(yōu)化蛋白質(zhì)序列,提升穩定性與產(chǎn)量
不同分子的表達情況本就有較大差異,我們對不同分子進(jìn)行序列篩選,對于表達量不高的分子,我們會(huì )采用三個(gè)步驟對其進(jìn)行優(yōu)化:
? 密碼子優(yōu)化:通過(guò)優(yōu)化密碼子使用,增加分子的表達量。這一策略不改變分子的氨基酸序列,從而保持蛋白質(zhì)的二級和三級結構不變;
? 序列改造與截短:選擇合適的替代序列,提高分子表達量,并對蛋白質(zhì)的非功能性片段進(jìn)行截短,以最大限度保留功能性蛋白,進(jìn)而提高表達量。此外,我們還可以使用融合標簽蛋白以提高蛋白的溶解度和產(chǎn)量;
? 抗體序列篩選與基因工程優(yōu)化:針對抗體藥物,通過(guò)選擇適當的重鏈/輕鏈(VH/VL)框架對,并進(jìn)行基因工程優(yōu)化以調整重鏈和輕鏈序列,優(yōu)化蛋白質(zhì)的三維結構,最終提升蛋白質(zhì)的熱穩定性。
在某項目中,我們通過(guò)序列風(fēng)險分析和點(diǎn)突變,成功將細胞池產(chǎn)量提高到原來(lái)的7.6倍,且未引起活性改變。

選擇宿主
精心挑選宿主細胞,適配多種蛋白需求
宿主細胞的選擇是難表達蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵。DTEasy平臺的宿主選擇策略基于不同蛋白類(lèi)型和目標應用的特性:
? 優(yōu)先選用哺乳動(dòng)物細胞:相比其他表達系統,哺乳動(dòng)物細胞能更好地進(jìn)行蛋白折疊和二硫鍵形成,確保表達的蛋白具有更高的生物相似性;
? GlycoExpress®(GEX)細胞系:對于需要高度糖基化修飾的內源蛋白,如凝血因子和FSH、GH等激素蛋白,漢騰生物采用專(zhuān)利的GlycoExpress®細胞系(GEX)。該細胞系不僅能提升表達量,其糖基化修飾也更接近人類(lèi)天然蛋白,適用于具有高度組織特異性的蛋白表達;
例如,在表達G 蛋白偶聯(lián)受體 GPCR 的胞外結構域時(shí),GEX® 細胞系的表達量相比傳統的 CHO-K1 細胞系可提升10倍之多。

通過(guò)精準篩選宿主細胞,能最大限度地提高難表達蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量,確保其在功能上符合藥物開(kāi)發(fā)的需求。
優(yōu)化載體
構建高效表達載體,提升蛋白合成效率
表達載體的設計會(huì )直接影響蛋白合成效率。漢騰生物的DTEasy工具箱通過(guò)優(yōu)化一系列措施改造表達載體系統,提升難表達蛋白的產(chǎn)量:
? 引入順式作用元件:通過(guò)轉錄組差異表達分析,將與蛋白產(chǎn)量正相關(guān)的順式作用元件插入載體中,從而提升轉錄效率;
? 設計多拷貝載體或專(zhuān)用載體:針對不同類(lèi)型的重組蛋白,通過(guò)選用多拷貝載體或定制的難表達蛋白專(zhuān)用載體,可提升100%-400%的蛋白產(chǎn)量。

? 添加共表達抑制劑或配體:加入共表達抑制劑,以減少難表達蛋白表達過(guò)程中的細胞毒性,或添加蛋白特定配體以進(jìn)一步提升表達量,確保表達產(chǎn)量提升到最佳水平。
通過(guò)以上組合優(yōu)化設計,DTEasy平臺在難表達蛋白的合成效率和產(chǎn)量上取得顯著(zhù)提升,滿(mǎn)足了客戶(hù)高標準的表達需求。
工藝優(yōu)化
定制化上游工藝開(kāi)發(fā)方案,顯著(zhù)提高難表達蛋白產(chǎn)量
在上游工藝開(kāi)發(fā)中,通過(guò)優(yōu)化細胞培養條件和添加定制培養基添加劑等策略,提升難表達蛋白的穩定性和表達量:
? 添加專(zhuān)屬添加劑:在培養過(guò)程中添加漢騰獨有的DTEasy專(zhuān)屬添加劑,能夠增強細胞對篩選壓力的耐受性,從而將蛋白產(chǎn)量提升至原表達量的3倍之多;

? 采用環(huán)軌搖晃式反應器:通過(guò)采用溫和的環(huán)軌搖晃式反應器,減少剪切應力和細胞損傷,延長(cháng)有效細胞培養時(shí)間,提升蛋白產(chǎn)量;
? CBoost® 加強型工藝:在培養基和培養條件的篩選中采用漢騰生物的CBoost®加強工藝平臺,可將難表達蛋白的產(chǎn)量提升2倍。
通過(guò)對上游生產(chǎn)工藝的精細調控,DTEasy平臺能夠顯著(zhù)提高難表達蛋白的產(chǎn)量,為客戶(hù)后續進(jìn)行進(jìn)一步CMC開(kāi)發(fā)提供了可靠的工藝基礎。
結論
漢騰DTEasy工具箱,釋放難表達蛋白潛力
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綜上,漢騰DTEasy平臺通過(guò)分子設計、優(yōu)選宿主、細胞系載體優(yōu)化以及定制工藝,多管齊下,全面解決了難表達蛋白的開(kāi)發(fā)痛點(diǎn)。借助DTEasy平臺,可幫助客戶(hù)釋放高價(jià)值但傳統上難以表達的治療性蛋白藥物的生產(chǎn)潛力,加快了開(kāi)發(fā)進(jìn)度,為患者獲得更加創(chuàng )新的生物治療藥物提供了更多機會(huì )。